1.应该在细胞状态最好的时候,进行病毒接种或复苏;
2.接种前头天,进行细胞传代,细胞数量应以能让细胞在第二天内达到覆盖满90%的培养瓶为准,并且一定要在细胞传代后48h内接种病毒;
3.第二天细胞长为单层且状态较好时,开始接种病毒;
4.先移弃培养瓶中的生长液,用1*PBS轻轻洗细胞面3次,最后用移液管吸干净培养瓶中残留的1*PBS.为保持培养瓶中pH环境的稳定,及减少1*PBS对细胞的刺激作用,可再用生长液轻轻洗细胞面1次,移弃液体,并用移液管吸干净瓶中残留生长液;
5.接种病毒:
①. 一般种毒量按最后所需加入维持液体积的10%,15%或20%来计算,一般10%即可,若希望病变速度快一些,可以加大种毒量,如15%或20%;
②. 如果用小塑料瓶种毒,一般该培养瓶加8-9ml培养液,加入0.8ml病毒即可,病毒加入后,盖上瓶塞,轻轻将摇晃瓶子,让病毒液在细胞面上来回10几次;
③. 在对照细胞中,加入相同的0.8ml维持液;
6.将种毒瓶和对照瓶一起放入37oC,CO2烘箱培养1h,其中每隔15min,需要将种毒瓶和对照瓶拿出,轻轻摇晃瓶子,保证病毒液或维持液能在细胞面上来回20-30次,使病毒液或维持液能充分接触细胞;
7.1h后,在晃动瓶子4次后,重新进入无菌间,在培养瓶中加入维持液;
①. 维持液配方一:
MEM 2鸖 3%谷氨酰胺 1%双抗 NaHCO3(其用量以调节pH至7.0为准,浓度为6%);
②. 维持液配方二:
MEM 3%谷氨酰胺 1%双抗 NaHCO3(其用量以调节pH至7.0为准,浓度为6%);
③. 一般还是使用有FBS的维持液,因为对细胞有一定的保护作用;
8.将加完维持液的培养瓶放回37oC,CO2烘箱培养,每天观察,如果有条件,可以每天拍照,直到有90%的细胞出现CPE后,可以进行收毒;
9.收毒可以用反复冻融方法:即将细胞培养瓶放入-20oC冰箱,冻起来后,直接拿出来等起融化后,使劲摇晃瓶子,让细胞破裂释放出病毒颗粒,这样反复4次,即可达到收毒目的;
10.收毒后的病毒液可以用移液管吸入离心管,在1,000-2,000转下离心10mins,以此除去细胞碎片,将离心后的上清夜转移,弃底部沉淀,该上清液即可用于病毒浓缩醇化,或病毒滴度测定,或中和试验等.
